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舟山市贝类副溶血性弧菌污染状况监测及不同来源菌株的毒力基因分析

时间:2011-05-20作者:唐丽华,王虹玲来源:中国论文库
字号:T|T

摘要:目的监测
2009年舟山市海产贝类副溶血性弧菌的污染状况,分析贝源分离株和临床分离株的毒力基
因分布情况,了解舟山市副溶血性弧菌的流行规律。方法分春夏秋冬四

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摘 要:目的 监测
2009 年舟山市海产贝类副溶血性弧菌的污染状况,分析贝源分离株和临床分离株的毒力基
因分布情况,了解舟山市副溶血性弧菌的流行规律。方法 分春夏秋冬四季对 80 份舟山市售海产贝类中的副溶血性弧菌进行监测,并对 50 株

贝源分离株和 18 株部分散发腹泻病例和食物中毒临床分离株进行部分血清分型及tdh、trh、orf8 和 toxRS / new 4 种毒力基因检测。结果

春(85% ) 、夏(80% ) 、秋(75% ) 三季的检出率差异无显著性 ,冬季检出率(10% )明显低于其它季节(P < 0. 01)。贝源分离株 tdh、

toxRS/new 和 orf8 基因检测结果均为阴性,只有冬季检出的 2 株 trh 阳性。临床分离株中有 14 株 tdh、toxRS/new 和 orf8 基因均为阳

性,1 株 trh 阳性,其余 3 株 4种毒力基因均为阴性,说明这 18 株中有 14 株(占 77. 78% )属于大流行株,其中 13 株(占 92. 86% )为

O3∶K6 型,1株为 O1∶KUT 型。结论 春、夏、秋三季海产贝类中副溶血性弧菌的污染率比较高;污染的贝类海产品可能是人感染副溶血性弧菌

的主要污染源;一群关系密切,tdh、orf8、toxRS/new 均为阳性的 O3∶K6 克隆群在舟山成优势流行。
关键词:副溶血性弧菌;毒力基因;监测
中图分类号:S85; R37 文献标识码:A 文章编号:1004-8456(2011)02-0123-04
    副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)是一种 分布极广的海洋细菌,夏季海水及海产品中常带有此菌。有调查表明,海产品中尤以贝

壳类动物中副溶血性弧菌污染程度最为严重[1]。近年来随着生活水平的提高、饮食模式的多样化,人们把生食或半生食贝类、甲壳类海产品

作为一种时尚饮食习惯,因此副溶血性弧菌中毒呈显著上升趋势,已占各类食物中毒事件的首位。舟山市贝类资源丰富,又是著名的旅游胜地

,几乎每年都有本地居民或外地游客因食用海产贝类而引起食物中毒。副溶血性弧菌是重要的食源性致病菌,副溶血性弧菌食物中毒占各类食

物中毒事件的 70% 以上[2]。为此,对舟山市贝类海产品中的副溶血性弧菌进行监测,并对这些贝源分离株及部分人源分离株进行血清型分

型和 tdh、trh、orf8 和 toxRS/new 4 种毒力基因检测,以了解舟山市副溶血性弧菌的流行规律及毒力基因携带情况。
    1 材料与方法
    1. 1 试剂API 20NE 试剂条 ( 法国生物梅里埃公司 ),科玛嘉弧菌显色培养基(郑州博赛生物技术股份有限公司),三塘铁培养基、碱性蛋

白胨培养基和胰酪胨大豆琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司)。副溶血性弧菌血清诊断试剂盒(日本生研所)。毒力基因引物[金思特(南京)有

限公司]。
    1. 2 贝类样本和临床菌株来源
    2009 年在舟山市水产营销论文" target="_blank">市场随机采集人们经常生食和半生食的贝类海水产品,如毛蚶、蛏子、花蛤、海瓜子、贻贝、牡蛎及各种海螺等鲜活

贝类。采样时充分考虑环境温度(养殖水温)的影响,同时兼顾样品的代表性。采样周期为 1 年,分春(4 月)、夏(8 月)、秋(11 月)、冬(1 月

)四季共进行 4 次,每次采集 20 份。样品采集后立即进行副溶血性弧菌分离,分离后的菌株磁珠于 - 70 ℃ 长期保存。
    18 株人源株由 2009 年 6—10 月间食物中毒病人和散发腹泻病人体内分离得到。
    1. 3 副溶血性弧菌的分离与鉴定按 GB 4789. 7—2003《食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验》[3]方法进行。
    1. 4 菌株血清学分型
    11 种 O 血清和常见 K 血清为日本生研所产品,在有效期内使用。取一定量细菌于生理盐水中,将菌悬液转移到离心管内,121 ℃ 灭菌

1 h,灭菌后4 000 r / min离心 15 min,弃上清,沉淀用生理盐水洗涤 3 次,每次按4 000 r/min离心 15 min,最后一次取沉淀菌体与 O 血

清进行凝集,同时以生理盐水作对照。
    1. 5 毒力基因 tdh、trh、orf8 和 toxRS / new 检测引物序列参照文献[4],见表 1。PCR 扩增体系:总反应体系为 25 μl,包括 10

× 缓冲液 2. 5 μl、引物 20 μmol/L、MgCl22 mmol / L、dNTPs 2 mmol / L、Taq 酶 1 U、细菌 DNA 粗制模板 2. 0 μl,H2O 补足 25μ

l。tdh 和 trh 的反应条件:94 ℃ 预变性 3 min,94℃ 55 s、50 ℃ 50 s、72 ℃ 2 min,循环 30 次,72 ℃ 延伸 10 min;orf8 和

toxRS/new 的反应条件:94 ℃ 预变性 3 min,94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s,循环 35次,72 ℃ 延伸 5 min。取扩增产物 8 μl 在

1. 5% 琼脂糖凝胶上电 泳,用 AlphalmagerTM凝 胶 成 像 系 统照相。
    2 结果
    2. 1 不同季节海产贝类中副溶血性弧菌的监测结果对不同季节的 80 份鲜活贝类水产品进行副溶血性弧菌检测,结果显示:春、夏、秋三

季间检出率差异无统计学意义,冬季检出率最低,与春、夏、秋三季的差异显著(P < 0. 01)。
    2. 2 血清分型结果
    贝类中分离的 50 株副溶血性弧菌菌株(除 1 株不能分型外)分属 7 个血清群,18 株人源株有 13 株(72. 2% )属于 O∶3 群,且均为 O3

∶K6 型,4 株属于O∶1群,1 株属于 O∶4 群。
    2. 3 毒力基因 tdh、trh、orf8 和 toxRS / new 检测结果50 株贝源分离株中只有冬季检出的 2 株 trh 阳性,其余 48 株 4 种毒力基

因均为阴性。18 株人源分离株中 14 株 tdh、toxRS/new 和 orf8 3 种毒力基因为阳性,1 株 trh 阳性,其余 3 株 4 种毒力基因均为阴性


    3 讨论
    3. 1 舟山市不同季节海产贝类中副溶血性弧菌污染情况本研究对舟山地区不同季节海产贝类中的副溶血性弧菌污染情况进行调研,研究结

果显示,舟山地区海产贝类中副溶血性弧菌污染情况严重。
    尤其是春夏秋三季,60 份样品中检出 48 株副溶血性弧菌,阳性率为 80% 。这可能与舟山地处沿海地区,海洋环境中本身含有大量的副

溶血性弧菌,而贝类作为一种“非选择性滤食”的海洋生物,对环境污染物包括病原微生物的“富集”能力强有关。而冬季贝类中副溶血性弧

菌的检出率比较低,20 份样品中检出 2 株,可能是水环境太冷而难以适合副溶血性弧菌的生长,所以春夏秋三季都是副溶血性弧菌引发腹泻

的流行期。建议卫生监督部门在此期间特别加强对海鲜大排档、水产加工销售的酒楼和宾馆的餐前监督,减少副溶血性弧菌引起的食物中毒事

件的发生;同时,疾控部门应加强宣传教育,预警高危食品,提高民众的公共卫生意识;另外消费者也应该自觉加强防范,少吃或者禁吃生鲜海

产品。
    3. 2 不同来源副溶血性弧菌血清型分布情况贝类中分离的 50 株菌株经副溶血性弧菌 11 种O 血清凝集分群,分属于 7 个血清群: O ∶

1 群、O ∶ 2群、O∶3 群、O∶4 群、O∶5 群、O∶10 群、O∶11 群,其中O∶1群、O ∶ 10 群、O ∶ 11 群均有 11 株,共占 66% 。 提示

舟山市贝类海产品中携带的副溶血性弧菌呈多样性分布。而人源副溶血性弧菌的血清型分布则相对比较集中,18 株人源株中有 13 株属于 O∶

3 群,且均为 O3∶K6 型,占 72. 2% ,4 株属于 O∶1 群,1 株属于 O∶4 群。
    3. 3 不同来源副溶血性弧菌的毒力因子分布情况副溶血性弧菌能产生两种主要的毒力因子,耐热直接溶血素(TDH) 和 TDH 相关溶血素

(TRH),有些菌株能同时产生两种毒素。1996 年后,一种新的仅 TDH 阳性的 O3∶K6 群副溶血性弧菌菌株引起了包括亚洲、美洲等多个国家在

内的大流行,研究发现这种新流行株均带有 orf8 基因,该基因编码一种粘附蛋白,使得细菌对宿主肠道细胞或海洋生物表面的粘附能力增强

[5,6]。另外有研究表明大流行株中均携带有 toxRS/new 基因,该基因编码与菌株毒力相关的穿膜蛋白[4]。也有研究表明 toxRS/new基

因的存在是大流行株的必要不充分条件,而 orf8基因的存在是大流行株的充分不必要条件[7]。本研究中毒力基因检测结果显示,50 株贝源

分离株tdh、toxRS / new 和 orf8 检测结果均为阴性,只有冬季检出的 2 株 trh 阳性;18 株临床分离株中有 14 株tdh、toxRS / new 和

orf83 种毒力基因为阳性,说明这18 株中有 14 株 ( 占 77. 78% ) 属于流行株,其中 13株(占 92. 86% )为 O3∶K6 型,1 株为 O1∶KUT

型,说明一群关系密切、tdh 阳性、toxRS/new 阳性、orf8 阳性的 O3∶K6 克隆群的流行株在舟山呈优势流行,这也与近年来国内外的相关报

道一致[4,8]。另外 18株临床株中,有 3 株为非致病株,至于非致病株侵入患者体内并致病的机制,目前尚不清楚。虽然环境株中很难检

出致病株,但这并不意味着不是食源性疾病发生的重要流行病学因素,而是外环境中存在的副溶血性弧菌复杂性的一个反映。可能是因为环境

中非致病株占绝对的主导优势,掩盖了致病株,传统方法很难检出致病株,至于如何提高环境中致病性副溶 血性弧菌的检出率 还 有 待 进

一 步研究。
    参考文献
    [1 ] 刘秀梅,程苏云,陈艳,等. 2003 年中国部分沿海地区零售海产品中副溶血性弧菌污染状况的主动监测[J]. 中国食品卫生杂志

,2005,17(2):97-99.
    [2 ] 薛超波,龚红霞. 浙江省舟山市海产品中副溶血性弧菌的定量检测[J]. 疾病监测,2008,23(7):343-346.
   
 

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