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综述·讲座线粒体 DNA 缺失细胞的培养方法及评价

时间:2011-05-20作者:张国桥,陈 宏来源:中国论文库
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线粒体DNA缺失细胞(RHO0、ρ0)是指一类线粒体内DNA缺失、无线粒体功能、依靠糖酵解存活的细胞系。关于线粒体基因表达的调控和核基因的作用目前了解得很少,特别

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   线粒体 DNA 缺失细胞( RHO0、ρ0) 是指一类线粒体内DNA 缺失、无线粒体功能、依靠糖酵解存活的细胞系。关于线粒体基因表达的调控

和核基因的作用目前了解得很少,特别是线粒体基因组及其功能对线粒体核基因表达的影响,了解线粒体的分子机制有助于了解乳腺癌、前列

腺癌、胰腺癌及侵袭转移性肿瘤的病因、发病机理,最终为治疗这些疾病提供理论依据。因此,建立无线粒体 DNA 细胞模型为研究线粒体的重

要功能,如氧化磷酸化、ATP 产生、电子链的传递、活性氧的产生,是目前细胞研究中的一大热点。目前对于 RHO0的诱导培养方法较多,较经

典的是溴化乙锭诱导法,其他的有抑制呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ的鱼藤酮及抗霉素 A诱导法、抗癌药物地特氯铵( ditercalinium) 诱导法、抗爱滋

病药物双脱氧胞苷诱导法、质粒转染诱导法。
    1 溴化乙锭诱导法
    溴化乙锭抑制 mtDNA 的复制和转录,而不影响核 DNA( nDNA) 的复制和转录〔1〕。Slonimski 等〔2〕1968 年第一次在体内用酿酒酵母

菌缓慢暴露于溴化乙锭,从而导致了呼吸链表型的缺陷。Desjardins 等〔3〕1985 年于鸡胚胎成纤维细胞中建立了线粒体 DNA 缺失细胞株。

鸡胚胎成纤维细胞对氯霉素存在耐药性,而对嘧啶却表现为营养缺陷。后来研究者发现,鸡胚胎成纤维细胞需要外源性的嘧啶和鸟苷才能存活

和增殖〔4〕。这些发现说明呼吸链功能的维持必须有嘧啶的合成,因为线粒体内膜含有黄素蛋白,二氢乳清酸脱氢酶在电子传递链中把二氢乳

清酸转换给乳清酸盐以便黄素腺嘌呤二核苷酸( FAD) 的再循环。
    RHO
    0是通过长期暴露于低浓度的溴化乙锭而建立的,溴化乙啶可以与 mtDNA 的双链较牢固结合,抑制细胞分裂时的 mtDNA 的复制,使细胞分

裂和线粒体复制分裂后mtDNA 数 量 减 少 1 /2,逐 次 减 少,数 量 表 示 为 原 来数 量 的1 /2n。通过对于细胞线粒体内有限的 mtDNA

拷贝,当分裂次数 n 足够大时,数量的 1/2n将小于 1 或更小,即细胞线粒体内没有有效的 mtDNA。对于线粒体平均 10 000 个 DNA分子,计

算可知,分裂 14 代后,线粒体内 DNA 数量将为10 000 /214,即 0. 6 个。继 续 培 养,即 可 以 清 除 所 有mtDNA〔5〕。人类第一个

RHO0株是 King〔5〕于 1989 年在骨肉瘤细胞 143B. TK 中制备成功的,随后又有很多种细胞被陆续培养成 ρ°细胞株,包括 143B、GM701

、Hela、A549、Namala等,但仍有许多细胞株不能被诱导成功,如 Hela F135、HelaBU25 以及几种来源于 Hep3B 的肝细胞株。
    培养中应注意试剂的浓度和有效期,溴化乙啶可与滤膜结合而损失,需使用 10 mg/ml 浓度进行超滤,以保证超滤后的有效浓度,然后再

稀释; 尿嘧啶和丙酮酸在使用中也需要注意低温和有效期,尿嘧啶和丙酮酸均应在 - 20 ℃ 保存,4 ℃ 储存环境一般在 1 个月内有效。
    King
    〔5〕有一简单方法,可较快鉴别细胞系能否培养成RHO0细胞: 应用去除嘧啶的血清和 50 ng/ml 溴化乙啶,在加或不加 50 μg/ml 尿嘧

啶的高糖培养基中培养细胞。如果细胞在无尿嘧啶的培养基中死亡,而在有尿嘧啶的培养基中正常生长,则该细胞具有较强的培养成 RHO0细胞

的潜力;
    如果两种培养基中细胞均正常生长,则该细胞可能对药物有耐性,不能失去 mtDNA,很难培养成 RHO0细胞; 如果两种培养基中细胞均死亡

,也不可能培养成 RHO0细胞。笔者曾应用溴化乙啶诱导肝癌 HpG2 及胃癌 SGC7901,在诱导至 9 ~11 代时,细胞逐渐悬浮、肿胀,继而大量

漂浮死亡。
    由于溴化乙啶价格低廉,操作简便,方法可靠,可抑制整个胞浆中的线粒体 DNA 的复制,分裂 14 代后线粒体 DNA数量几可忽略不计,目

前成为诱导线粒体缺失 DNA 的经典方法。由于溴化乙锭是一种诱变剂,有致癌性,因此,在使用时应带手套,对于接触过的台面及物品应用清

水大量冲洗及高锰酸钾侵泡消毒。这也限制了溴化乙啶的大量使用。
    诱导成功后的 RHO
    0株必须经过有限稀释克隆培养,使之成为线粒体 DNA 完全缺失的细胞株,并通过 PCR 及Southern 杂交、生长营养缺陷鉴定。其中

Southern 杂交是金标准,在亲本细胞中有线粒体编码的基因杂交条带显示,而在线粒体 DNA 完全缺失的细胞株中无相应杂交条带显示,这样

线粒体 DNA 缺失细胞株方能证明真正培养成功。
    2 抑制呼吸链复合物
    呼吸链酶系是位于线粒体内膜的一个酶体系,由 4 个酶复合体( ComplexⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ) 和连通复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的辅酶 Q( CoQ) 以及

连通复合物Ⅲ和Ⅳ的细胞色素 C( Cytc) 组成。这一酶系催化生物底物的氧化,并与催化 ATP 合成的 ATP 酶相偶联,共同组成生物能量转化

的分子机构〔6〕。鱼藤酮、抗霉素A 是酶专一性的抑制剂。鱼藤酮作用于复合物Ⅰ,而抗霉素 A作用于复合物Ⅲ,噻吩甲酰三氟丙酮作用于复

合物Ⅱ。而复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均是由线粒体 DNA 编码,而复合物Ⅳ则是由核 DNA编码,因此,在细胞诱导中可以应用鱼藤酮、抗霉素 A 及噻

吩甲酰三氟丙酮有效抑制呼吸链,使 ATP 的生成急剧减少,细胞不能通过三羧酸循环获得能量 ATP,这样可抑制线粒体DNA 的复制。由于它们

具有酶的专一性,只能阻断其中的部分呼吸链,在抑制 DNA 方面不具有整体阻断性。且 DNA 在不停的复制,因此,专一性的阻断呼吸链的方

法不能真正用来建株。但是由于它们的特异性以及培养周期短,可用来测定比较线粒体 DNA 缺失的细胞和母本细胞株的一些生物学活性上的差

别。对于了解线粒体 DNA 缺失后对肿瘤细胞的表型、肿瘤增殖及分化有一定帮助。这种方法目前已经很少用来诱导培养线粒体 DNA 缺失株。
    3 地特氯铵诱导法
    地特氯铵是一个抗肿瘤活性的有双重功能的 DNA 嵌入分子。这种 DNA 嵌入剂起初设计是用来获得较高 DNA 结合活性的。它通常与双链

DNA 结合,也可形成 3 或 4 倍的稳定复合物结构,因此,地特氯铵是一种结构选择性的 DNA结合剂〔7〕。与 DNA 嵌入剂的单一功能相比较

,地特氯氨除了有较高的 DNA 结合活性外,尚有不同的细胞毒机制〔8〕。
    ( 1) 经过 6 ~8 代的增殖后,地特氯氨能诱导迟发性细胞毒作用。( 2) 可引起细胞周期的非特异性阻断。地特氯氨主要分布在细胞线粒

体而不是细胞核,因而主要损伤线粒体〔9〕,在药物所致的肝细胞毒中起着重要作用。由于地特氯氨选择性的诱导主要针对线粒体,因而使线

粒体 DNA 大量丢失〔10〕,最终造成氧化磷酸化底物的减少。
    溴化乙锭是一种亲脂性的阳离子,这些亲脂性的阳离子依赖线粒体膜电位大多聚集在线粒体内,因此,溴化乙锭首先抑制 mtDNA 的复制。

而地特氯氨呈颗粒状聚集在线粒体而不是细胞核,由于它是一种双功能的 DNA 嵌入分子,具有较高的 DNA 结合活性。作为核苷酸类似物,以

前理论上认为是复制的中间物,调控D -环区,抑制mtDNA 的复制,然而,地特氯氨并不调控线粒体 D -环区,它首先与富含 GC 碱基的双链

DNA 结合〔11〕,而线粒体保守序列封闭区( CSBII) 位于 D -环区,富含大量的 GC 碱基,CSB II 也涉及到含有 RNA 三级结构的 R 环区,

这样,CSB II 与 R 环区以及 D/R 环区紧密结合,更加进一步的抑制 mtDNA 的复制,地特氯氨嵌入到 DNA 内抑制 DNA 的合成,从而导致线

粒体 DNA 丢失。
    地特氯氨在诱导细胞培养时浓度一般为 1. 5 μg/ml,培养周期较溴化乙锭( 13 ~14 代,2 d 传代1 次) 长,约需2 个月,但种系谱宽

,在鼠及人源细胞中均能培育出 mtDNA 缺失细胞。而溴化乙锭在鼠类种系中常不能培育出 mtDNA 缺失细胞〔12〕。
    4 质粒转染诱导
    质粒转染诱导是近几年开展的新技术,主要原理是利用mtDNA 的 DNA 聚合酶 - γ抑制线粒体 DNA 的复制。mtDNA 的合成是通过多种蛋白

复制复合物来完成的,而 DNA 聚合酶 -γ是其中的必须成分。在哺乳动物中,DNA 聚合酶 -γ是仅有的针对线粒体的具有特殊效应的 DNA 聚

合酶。由于线粒体细胞依赖DNA 聚合酶 -γ,在人类细胞培养的增殖过程中,利用显性负相 DNA 聚合酶 -γ的异位表达能使 mtDNA 减少,这

种模式对于任何细胞类型都是必须的。2003 年 Jazayeri 等〔13〕利用含有编码无活性 DNA 聚合酶 -γ的质粒转染 HEK293 细胞,诱导表达

后,使细胞线粒体 DNA 迅速减少,20 d内可以将母代细胞转变为 RHO0细胞。
    总之,目前诱导线粒体 DNA 缺失的方法有很多,但每种方法都有它的优缺点。较之以往传统的方法,质粒转染诱导具有高度特异性、容易

控制性,且快速、可逆,适应于任何组织和细胞的优点。传统的溴化乙锭和地特氯氨则在诱导的过程中易出现耐药性、非特异性以及对核 DNA

造成损害,这样在 mtDNA 细胞中容易并发表型改变的翻译错误。尽管很多诱导方法为目前研究线粒体 DNA 缺失后对细胞表型的改变以及生物

学行为提供了多种实验研究模型,但是,由于一些诱导剂的副作用限制,在选择培养方法时,必须考虑到它的应用限制。笔者认为,质粒转染

诱导以后可能不失为一种培育的方向和模式。

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